第一節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)的必備設(shè)施
根據(jù)體外培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)特點(diǎn)和條件，擁有一個(gè)無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室、一臺(tái)超凈工作臺(tái)和一個(gè)恒溫培養(yǎng)箱是細(xì)胞培養(yǎng)的三大必備設(shè)施。
一、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室
無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室或操作室的設(shè)計(jì)原則是，有防止微生物污染和有害因素的影響措施，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新、干燥和無(wú)煙塵。無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室最好能單獨(dú)設(shè)置。如果條件有限，只能限制在一個(gè)大實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，應(yīng)劃分不同的功能區(qū)或用鋁合金隔板隔開(kāi)，將無(wú)菌操作室與清洗、消毒滅菌區(qū)、制備、儲(chǔ)藏和孵育區(qū)分開(kāi)。
無(wú)菌操作區(qū)只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無(wú)菌操作的區(qū)域。亦可把凈化工作臺(tái)置于操作室中，這樣更為安全。此室最好能與外界隔離，不能穿行或受其他因素干擾。操作室的大小依需要而定，一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。更衣間放在外，主要供更換衣帽、鞋子等。緩沖間位于更衣間與操作間之間，也可同時(shí)和幾個(gè)操作間相通。操作間放在內(nèi)間，主要供無(wú)菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)，房間應(yīng)不受日光直射，大小適當(dāng)，高度適宜(2.5m)。房間過(guò)大，清掃和消毒不便；過(guò)小，操作不便；頂部過(guò)高會(huì)影響紫外線的有效滅菌效果。墻壁應(yīng)光滑無(wú)死角，以便清洗和消毒。工作臺(tái)不應(yīng)緊靠墻壁放置，臺(tái)面漆成白色或灰色，以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。若能購(gòu)置超凈工作臺(tái)則更好。無(wú)菌操作間應(yīng)為密閉式，設(shè)置空氣消毒用的紫外線燈、空氣過(guò)濾凈化器和恒溫裝置。如果條件有限，僅做一般要求的細(xì)胞培養(yǎng)，在相對(duì)狹小的空間內(nèi)，只設(shè)置凈化臺(tái)而不設(shè)操作室。但要注意季節(jié)氣候環(huán)境的影響和注意無(wú)菌操作環(huán)節(jié)。做要求較高的細(xì)胞培養(yǎng)，最好設(shè)置無(wú)菌操作室，有條件的應(yīng)設(shè)凈化工作室，以避免季節(jié)影響和杜絕污染。
二、凈化工作臺(tái)
也稱超凈工作臺(tái)。目前大多數(shù)從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的實(shí)驗(yàn)室都已裝備了超凈工作臺(tái)。這種工作臺(tái)占據(jù)空間小，安裝方便，操作簡(jiǎn)單，投資少，效果不比無(wú)菌操作室差，即使不設(shè)置單獨(dú)的無(wú)菌實(shí)驗(yàn)室，只要購(gòu)置安裝了超凈工作臺(tái)，也能進(jìn)行簡(jiǎn)單的細(xì)胞培養(yǎng)工作。
超凈工作臺(tái)種類繁多，但主要有三大類：一類是測(cè)流式；第二類為流直式；第三類為外流式，或稱為水平層流式。它們的基本工作原理大同小異：內(nèi)設(shè)鼓風(fēng)機(jī)，驅(qū)動(dòng)空氣通過(guò)高效濾器過(guò)濾凈化后，讓凈化空氣徐徐通過(guò)臺(tái)面空間，使操作區(qū)構(gòu)成無(wú)菌環(huán)境。它們的區(qū)別在于氣流的方向不同，側(cè)流式即凈化后氣流由左側(cè)或右側(cè)通過(guò)臺(tái)面流向?qū)?cè)；直流式為氣流從上向下或從下向上流動(dòng)；外流式為氣流向操作者方向吹來(lái)。這三類工作臺(tái)各有利弊。側(cè)流式和直流式能形成氣流屏而保持操作臺(tái)無(wú)菌，但在凈化氣流和外界氣體交界處可因氣流的流動(dòng)形成負(fù)壓，使少許未凈化氣體混入，有可能發(fā)生污染，尤其在多雨季節(jié)的南方，會(huì)增加污染機(jī)會(huì)。外流式工作臺(tái)因氣流面向操作者流動(dòng)，外方氣流不易混入，但在做有害實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)操作者健康不利。使用此類工作臺(tái)一般可用有機(jī)玻璃將上半部遮擋，讓氣流從下方通過(guò)，以盡量減少其不利影響。現(xiàn)在很多實(shí)驗(yàn)室普遍使用的側(cè)流式工作臺(tái),是一種封閉式的工作臺(tái),兩個(gè)側(cè)面各留兩個(gè)圓洞，供操作者手臂伸入進(jìn)行操作，污染機(jī)會(huì)極少。但要拿取較大物品或進(jìn)行較大范圍的操作就不夠方便。
超凈工作臺(tái)作為一種設(shè)備也需要維護(hù)和保養(yǎng)，才能延長(zhǎng)其使用壽命。一般應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：
（1）超凈工作臺(tái)一般宜安裝在避免日光直射、清潔無(wú)塵的房間內(nèi)。若能放在無(wú)菌操作區(qū)內(nèi)則更佳，不僅效果好，而且濾器（料）的使用壽命長(zhǎng)。
（2）久未使用的工作臺(tái)在使用前應(yīng)進(jìn)行徹底清洗、消毒滅菌。用1:1000的來(lái)蘇兒或75%的酒精擦洗臺(tái)面，濾器械的灰塵可用真空吸塵器清除。停止使用時(shí)最好用作防塵布或塑料布套好，避免灰塵積聚。
（3）凈化工作臺(tái)內(nèi)不應(yīng)放置其他與細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)關(guān)的用品，更不能用作儲(chǔ)存室。每次使用前半小時(shí)先開(kāi)紫外線燈滅菌，再關(guān)滅菌燈啟動(dòng)風(fēng)機(jī)，然后進(jìn)行培養(yǎng)操作。
（4）不設(shè)在無(wú)菌操作區(qū)內(nèi)經(jīng)常使用的凈化臺(tái)，要注意過(guò)濾器的效果。一般2~3年更換一次，3~6個(gè)月拆下清洗一次，以保持過(guò)濾器的凈化效果。
三、恒溫培養(yǎng)箱
用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)箱分變通電熱恒溫培養(yǎng)箱和CO2培養(yǎng)箱。溫控變化一般不超過(guò)±0.5℃,最適溫度為37℃。因此要求培養(yǎng)箱具有較高的靈敏度。控溫裝置的優(yōu)劣是電熱恒溫箱質(zhì)量的關(guān)鍵，選購(gòu)時(shí)一定要注意。一般選購(gòu)隔水式或晶體管式控溫培養(yǎng)箱，適用于封閉式的培養(yǎng)。
CO2培養(yǎng)箱在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室已得到普通的使用。它能提供較為恒定的CO2，通常為5%，使培養(yǎng)液的pH保持穩(wěn)定，適用于開(kāi)放式或半開(kāi)放式的培養(yǎng)。需要注意的是：為了避免污染，要對(duì)培養(yǎng)箱定期進(jìn)行消毒，如有紫外燈則用紫外線消毒，如無(wú)紫外燈須用酒精定期擦試消毒。另外，要維持箱內(nèi)溫度、濕度的恒定，可用無(wú)菌蒸餾水定期注入外箱內(nèi)，或用無(wú)菌潮濕的紗布置于托盤(pán)內(nèi)，然后將培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板置于上面，再放入CO2培養(yǎng)箱，以保持濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)。
四、其他設(shè)備
進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)除了上述三大設(shè)備外，還需配備電熱干燥箱、冰箱、水純化裝置、普通光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡、細(xì)胞液氮儲(chǔ)存器、離心機(jī)、消毒器、抽濾裝置等。
電熱干燥箱：主要用于烘干熱消毒玻璃器皿，也可用于干熱消毒。在用于干熱消毒時(shí)，溫度一般要求達(dá)到160℃(滅菌)或180℃(去除熱原)，消毒時(shí)間須在2h以上。細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室常用的干燥箱為鼓風(fēng)式電熱干燥箱（規(guī)格為5605 mm×500 mm×500mm），雖然升溫較慢，但溫度均勻，效果較好。鼓風(fēng)與升溫同時(shí)開(kāi)始，待溫度達(dá)100℃后再打開(kāi)，以避免玻璃器皿突然遇冷而炸裂損壞。金屬解剖器械、塑料制品、橡膠制品等不能放在干燥箱內(nèi)滅菌。
冰箱：一般用雙門(mén)冰箱，既有4℃左右的冷藏區(qū)，又有-20℃以下的冷凍區(qū)。如條件許可，應(yīng)有一臺(tái)普通冷藏冰箱和一臺(tái)低溫冰箱（<-70℃）。前者主要用于儲(chǔ)存培養(yǎng)液、生理鹽水、Hanks液、試劑等培養(yǎng)用的物品和短期保存的組織標(biāo)本。后者用于保存需較長(zhǎng)時(shí)間存放的制劑，如酶、血清和組織標(biāo)本等。冰箱應(yīng)保持清潔，防止污染。禁止存放有毒、易燃、易揮發(fā)物品。
顯微鏡：應(yīng)有一臺(tái)普通顯微鏡和一臺(tái)倒置顯微鏡。前者用于細(xì)胞計(jì)數(shù)和一般觀察，后者用于觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況和有無(wú)污染。若條件許可，應(yīng)配置照相系統(tǒng)和熒光顯微鏡。
水純化裝置：這也是細(xì)胞培養(yǎng)不可缺少的設(shè)備。因?yàn)轶w外培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)水的要求較高，無(wú)論是細(xì)胞培養(yǎng)液還是配試劑等都應(yīng)使用兩次以上蒸餾的雙蒸水。離子交換裝置處理的水因?yàn)椴荒芡耆コ袡C(jī)物而極少應(yīng)用。外售蒸餾水常用金屬器蒸餾，易混入金屬離子，須用玻璃蒸餾器重新蒸餾一次后才能使用。目前國(guó)內(nèi)普通使用的是自動(dòng)雙重純水蒸餾器(碳管加熱)，較為安全、方便、蒸餾速度也較快，但不宜直接用自來(lái)水蒸餾。配制培養(yǎng)液的水應(yīng)用配液前蒸餾的新鮮三蒸水。
細(xì)胞冷凍貯存器：主要是液氮容器。國(guó)產(chǎn)的能滿足要求。容積大小根據(jù)實(shí)驗(yàn)室需求選購(gòu)。一般小實(shí)驗(yàn)室用35L3的，大實(shí)驗(yàn)室，多可購(gòu)50 L3的。窄頸瓶維持液氮時(shí)間長(zhǎng)（1月左右），但存取不方便。寬頸瓶存取方便，但維持液氮時(shí)間短（7~10天）。定期加液氮的時(shí)間可據(jù)此來(lái)確定。由于液氮溫度達(dá)-196℃，使用時(shí)要防止凍傷手。
離心機(jī)：一般應(yīng)配有普通離心機(jī)，最好應(yīng)配置高速冷凍離心機(jī)。普通離心機(jī)轉(zhuǎn)速在4000r/min以下，臺(tái)式的就可滿足要求。用于制備細(xì)胞懸液、漂洗、分離細(xì)胞。若開(kāi)展細(xì)胞脫核、DNA和RNA抽提、組織勻漿等研究，需使用高速、大容量和能進(jìn)行調(diào)溫的離心機(jī)。
清毒器：一般常用小型手提式高壓蒸氣消毒器。它可用于無(wú)法干熱高溫烘烤消毒的各種塑料培養(yǎng)用品、橡膠制品等的消毒。
抽濾裝置：有Zeiss濾器、玻璃濾器和金屬濾器。濾器中的濾膜一般用0.2～0.3μm孔徑的微孔濾膜。凡在高溫或射線下易發(fā)生變性或失去功能的物質(zhì)，如人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等都須用濾器過(guò)濾除菌。
第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)常用器材及處理方法
體外培養(yǎng)細(xì)胞使用的器材品種較多。由于離體細(xì)胞對(duì)各種毒物都很敏感，所以細(xì)胞培養(yǎng)所用器材的清洗、消毒處理是培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵之一。
一、玻璃器材
常用的玻璃器材有各種規(guī)格的玻璃瓶、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、吸管、離心管等。
無(wú)論是初次使用還是培養(yǎng)后重復(fù)使用的玻璃器材均需要進(jìn)行消毒處理。首次使用的玻璃器材應(yīng)先用自來(lái)水初步刷洗，然后用稀鹽酸溶液（1%）浸泡過(guò)夜，再用自來(lái)水沖洗，最后處理方法與重復(fù)使用的器皿的處理。
重復(fù)使用的玻璃器皿的處理步驟：
（1）刷洗。用軟毛刷和優(yōu)質(zhì)中性洗滌劑刷洗，去除器皿內(nèi)外表面的雜質(zhì)。刷洗時(shí)注意不要用力過(guò)重，以防損壞器皿內(nèi)表面光潔度，影響細(xì)胞生長(zhǎng)；也不能留有死角。器皿數(shù)量大時(shí)，可使用超聲波清潔裝置，沖洗干凈后晾干。
（2）清潔液處理。將刷洗晾干后的玻璃器皿放入硫酸-重鉻鉀清潔液中。清潔液配方如下，見(jiàn)表3-1：
表3-1 清 潔 液 配 方
|
名 稱
|
清 潔 液 濃 度
|
|
25%(弱液)
|
50%(次強(qiáng)液)
|
75%(強(qiáng)液)
|
|
重鉻酸鉀
|
1000g
|
1000g
|
1000g
|
|
濃 硫 酸
|
2500mL
|
5000mL
|
7500ML
|
|
蒸餾水(或廢液)
|
7500Ml
|
5000mL
|
2500mL
|
該清潔液具有高度腐蝕性，操作時(shí)必須穿長(zhǎng)筒膠靴，戴防酸橡皮手套，圍裙和眼鏡，以防清潔液濺出而灼傷。在配液時(shí)還需注意將酸緩慢放入水中，以防酸遇水放熱產(chǎn)生酸濺出或使玻璃及陶制容器裂開(kāi)而使清潔液外泄。切勿將水加入酸中，以防酸濺出。常用清潔液為75%和50%兩種。
將玻璃器皿放入時(shí)最好裝入塑料網(wǎng)袋內(nèi)，再浸入清潔液中，玻璃瓶?jī)?nèi)不要?dú)埩魵馀荨Ｒ话憬?/span>12~24小時(shí)后取出。在清潔液中取出的器皿先用自來(lái)水沖洗10次以上，再用單蒸水沖洗三次以上，最后用雙蒸水（或去離子水）沖洗1~2次，晾干，包裝殺菌。一般用121℃磅高壓蒸氣滅菌20分鐘。玻璃濾器使用后及時(shí)用自來(lái)水沖洗濾器表面的剩余物，然后用單蒸水浸泡，除去濾板內(nèi)堵塞雜物，若用濾膜則將濾膜丟棄，加4N鹽酸浸泡12小時(shí)以上，用自來(lái)水沖洗，再用單蒸水抽濾2次，雙蒸水(或去離子水)抽濾沖洗、包裝、121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。也可用5%潔消精浸泡20分鐘后，再按上述方法沖洗和滅菌。
二、塑料器材
體外培養(yǎng)細(xì)胞中塑料器皿的使用越來(lái)越多，有進(jìn)口的，也有國(guó)產(chǎn)的。主要有多孔培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸嘴。多孔培養(yǎng)板有4孔、6孔、24孔、96孔等規(guī)格可供選擇。多數(shù)為進(jìn)口產(chǎn)品，已消毒滅菌密封包裝，使用時(shí)只需打開(kāi)即可。
有一次性使用的，也有反復(fù)使用的。在我國(guó)不少實(shí)驗(yàn)室，由于經(jīng)費(fèi)有限，經(jīng)過(guò)清洗和消毒滅菌再使用的較多。
塑料器皿若使用后，先用自來(lái)水浸泡沖洗、晾干，再用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水充分沖洗，或先用2%NaOH處理之后再用3%HCl浸泡30分鐘，最后用自來(lái)水沖洗干凈，并用雙蒸水沖洗3次以上，晾干。消毒采用紫外線直接照射或輻照滅菌辦法。清洗時(shí)要防止產(chǎn)生劃痕，以免影響細(xì)胞的貼附性。所以，培養(yǎng)要求較高的細(xì)胞的塑料器材，最好一次性使用。
三、橡皮器材
應(yīng)選擇質(zhì)軟、耐高溫、毒性小的橡皮制品(最好是硅制品)做各種瓶或試管的塞子、蓋子。新購(gòu)置的橡皮制品，用自來(lái)水沖洗去除其表面粉粒和污物。先用5%氫氧化鈉煮沸15分鐘，用自來(lái)水沖洗8次，再用4%鹽酸煮沸15分鐘，用自來(lái)水沖洗8次，單蒸水沖洗3次，雙蒸水(或去離子水)沖洗一次，晾干后包裝或置于鋁盒內(nèi)，用121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
已用過(guò)的橡皮制品，先用自來(lái)水沖洗干凈，然后用洗衣粉加熱煮沸10分鐘后，用自來(lái)水邊沖邊用力攪動(dòng)，以充分洗凈殘余洗衣粉，然后用蒸餾水煮沸2次，每次15分鐘，再用單蒸水沖洗2次，必要時(shí)還要用雙蒸水(或去離子水)沖洗一次，晾干后包裝或放于鋁盒內(nèi)，用121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
四、金屬器材
細(xì)胞培養(yǎng)中需用多種金屬器材，用于解剖、取材、剪切組織及持取物件等，常用的有剪刀、鑷子、手術(shù)刀、解剖刀、血管鉗、組織鑷、眼科鑷及各種型號(hào)針頭等。新的金屬器材，先用紙擦去表面的油脂，再用洗衣粉煮沸，或用1%碳酸氫鈉煮沸15分鐘，擦干后再用95%酒精紗布擦干，包裝或置鋁盒內(nèi)于121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
已用過(guò)的金屬器材，及時(shí)用酒精棉球擦干凈，包裝入鋁盒內(nèi)于121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
五、其他物品
紗布先用自來(lái)水洗凈后，再用單蒸水沖洗，然后用單蒸水煮沸2次，每次15分鐘，并經(jīng)常用長(zhǎng)鑷子翻動(dòng)，再用單蒸水洗2次，晾干后折成八層包裝，用121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
注射器的針頭使用后，立即用自來(lái)水（或來(lái)蘇爾水）沖洗數(shù)次，沖洗出針頭內(nèi)的剩余物，以免堵塞針頭，然后用單蒸水洗2~3次，再用95%酒精沖洗3次，包裝或置鋁飯盒內(nèi)121℃高壓蒸氣滅菌20分鐘。
用于細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的各種人工合成培養(yǎng)液、緩沖液和酶濾液等也需要進(jìn)行除(滅)菌處理。緩沖液常用高壓蒸氣消毒。血清用56℃水浴滅活30分鐘。人工合成培養(yǎng)液等酶溶液用過(guò)濾除菌。安裝濾器時(shí)要防止濾膜裝偏而導(dǎo)致過(guò)濾失效，過(guò)濾時(shí)力量不能過(guò)大、過(guò)猛，以免濾膜破裂。濾液量多，用抽濾式或加壓式（正壓式）過(guò)濾裝置。濾液量少，可選用2.5cm直徑的小號(hào)濾器，直接套在小瓶（如青霉素瓶）上，以注射器推動(dòng)壓力過(guò)濾。
消毒滅菌前所用的包裝材料可用牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒和特制玻璃（或金屬）消毒筒等，可根據(jù)器材大小、形態(tài)選用，采取局部包裝或部分包裝，并用線繩扎緊。
第三節(jié) 常用溶液、培養(yǎng)液及其配制
體外細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用溶液和培養(yǎng)液的好壞，直接影響到細(xì)胞的生長(zhǎng)，配制時(shí)要十分注意。
一、平衡鹽溶液
平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)又稱生理鹽水或鹽溶液，是細(xì)胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無(wú)機(jī)鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度等重要作用。
(一)配液時(shí)的注意事項(xiàng)
（1）需用新鮮的三蒸水或去離子水，按規(guī)定的先后順序配制，稱量要準(zhǔn)確，要看清藥品的規(guī)格、純度、結(jié)晶水的數(shù)量等，切勿搞錯(cuò)。
（2）物質(zhì)的純度 純度高的物質(zhì)配制成的溶液質(zhì)量高，因此在配液選用時(shí)要注意。常用的純度有優(yōu)級(jí)純(特級(jí)純)，分析純（AR）和化學(xué)純（CD）三種類型。
（3）物質(zhì)的可溶性 很多用于培養(yǎng)用液的化學(xué)物質(zhì)都很難溶解，在配制時(shí)必須設(shè)法使其溶解。如磷酸鈣在堿性溶液中幾乎難于溶解，因此在制備磷酸緩沖液時(shí)，需將CaCl2及磷酸氫二鈉單溶后再混合，臨時(shí)用NaHCO3調(diào)pH至弱堿性，以避免沉淀析出。
（4）物質(zhì)的不穩(wěn)定性 不少物質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，高溫高壓下易破壞。如葡萄糖只能在10磅下維持15～20分鐘，若超磅葡萄糖就會(huì)破壞。
5、貯存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時(shí)混合和稀釋，過(guò)濾除菌備用。
(二)幾種常用溶液的配制方法
1、無(wú)鈣、鎂、離子溶液(1000ml)
氯化鈉(NaCl) 8g 磷酸二氫鈉(NaH2PO4H20) 0.05g
氯化鉀(KCl) 0.2g 碳酸氫鈉(NaHCO3) 1g
檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7,H20)1g 葡萄糖 1g
加去離子水或雙蒸水至1000mL
2、磷酸鹽緩沖液
甲液：0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液
磷酸氫二鈉(無(wú)水) 28.4g 氯化鈉 8.77g
加去離子水或雙蒸水至1000mL
乙液：0.2 mol/L磷酸二氫鈉溶液
磷酸二氫鈉(無(wú)水) 2.4g 氯化鈉 8.77g
加去離子水或雙蒸水至1000mL
甲、乙液于4℃保存，使用時(shí)按表3-2所示比例，配制成所需pH濃度，高壓滅菌后室溫保存。
表3-2 不同pH濃度所需甲液、乙液量 (mL)
|
pH
|
甲 液
|
乙 液
|
|
6.0
|
12.5
|
87.5
|
|
6.2
|
22
|
78
|
|
6.4
|
32
|
68
|
|
6.6
|
45
|
55
|
|
6.8
|
55
|
45
|
|
7.0
|
64
|
36
|
|
7.2
|
72
|
28
|
|
7.4
|
79
|
21
|
3、Hanks液
(1)母液甲(20x)配法
① NaCl(A.R) 160g
KCl(A.R) 8g
MgSO4.7H2O（A.R) 2g
MgCl.6H2O(A.R) 2g
依次溶于800mL雙蒸水中，前一物質(zhì)溶后再加后一種。
②CaCl2(A.R)2.8g溶于100mL雙蒸水中，溶時(shí)不斷攪拌（此液應(yīng)單配，單溶）。
待上述兩溶液中的“溶質(zhì)”全溶后，將它們混合，再用雙蒸水補(bǔ)至1000mL，向其中加2mL氯仿作為防腐劑，置4℃保存。
(2)母液乙(20×)配法
① Na2HPO4.12H2O(A.R)3.04g
KH2PO4(A.R) 1.20g
葡萄糖(A.R) 20.0g
溶于800ml雙蒸水中。
②0.4%酚紅液 0.4g酚紅放在玻璃研缽后加0.01N NaOH 11.28mL，直到全部溶解，移入100mL容量瓶中，加水至100mL，過(guò)濾，pH為7.4，4℃保存。
待上述各“溶質(zhì)”完全溶解后，用雙蒸水補(bǔ)至1000mL,其中加氯仿2mL作防腐劑，置40℃保存。
(3)使用液（1×）配法
取母液甲和母液乙各一份，加雙蒸水18份，分裝后，塞好瓶塞，掛上標(biāo)志。以115℃高壓滅菌25分鐘(以免葡萄糖破壞)，置室溫后4℃保存，可使用幾個(gè)月。臨用前，用7.5%NaHCO3調(diào)至所需pH。
二、其他溶液
1、pH調(diào)節(jié)液
(1)碳酸氫鈉液 可根據(jù)需要與使用方便配制10%以下的各種濃度。先用雙蒸水溶解后，需經(jīng)過(guò)濾除菌，分裝小瓶中。亦可使用高壓蒸氣滅菌，密封，4℃冰箱保存。市售有5%～10%濃度的安瓿封裝品，使用也很方便。在調(diào)節(jié)pH過(guò)程中或超過(guò)要求值時(shí)，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或以CO2調(diào)節(jié)之。
(2)Hepes緩沖液 是一種可以保持細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中pH值較長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑。通常使用濃度為10～15mmol/L。配制時(shí)，稱取所需的Hepes量，用培養(yǎng)液溶解，用1mmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，過(guò)濾除菌分裝小瓶中，4℃冰箱保存。
2、消化液
(1)胰蛋白酶溶液 它是一種黃白色粉末，易受潮，應(yīng)密封放置陰暗干燥處。它的主要作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解，從而使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫落并使細(xì)胞游離分散開(kāi)來(lái)。常用濃度為0.25%或5%。如5%胰蛋白酶溶液配制：
稱0.5g粉狀胰蛋白酶，溶于100mL無(wú)鈣鎂離子磷酸緩沖液中，置4℃過(guò)夜使其溶解，或?qū)⒎Q好的胰蛋白酶放入有刻度的燒杯中，先加入一半的磷酸緩沖液，在杯中放入一長(zhǎng)短適宜、外周包有塑料或玻璃外殼的磁力棒，將燒杯放置在帶有控溫和控速的磁力攪拌器上，令磁棒勻速旋轉(zhuǎn)攪拌1-2小時(shí)后，胰蛋白酶充分溶解，用濾紙粗濾后，再用玻璃或塑料濾器過(guò)濾除菌，分裝入小瓶，4℃保存，同時(shí)做無(wú)菌試驗(yàn)陰性后才能使用。
(2)EDTA(乙烯二胺與乙酸或Versene)溶液 EDTA是一種化學(xué)螯合劑，毒性小，對(duì)貼壁細(xì)胞有離散作用。一般使用濃度為0.02%。稱0.1gVersene溶解于500mL無(wú)鈣鎂離子磷酸緩沖液中，15磅30分鐘高壓滅菌，4℃或室溫保存。
(3)胰蛋白酶—EDTA的配制 0.5%胰蛋白酶液96mL，1%EDTA液4mL，無(wú)鈣鎂離子緩沖液100mL。
3、抗生素溶液
為防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生污染，一般在培養(yǎng)液中加入青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素，其濃度分別為每毫升含100U和100μg 。配制時(shí)取青霉素1×106和鏈霉素1×106μg,溶于100mL Hanks或PBS中，使其含量為青霉素1×104U/mL，鏈霉素1×104μg/mL，使用時(shí)每100mL培養(yǎng)液中加入0.5~1mL。
4、0.5%臺(tái)盼蘭(Trypan blue)液
稱取臺(tái)盼蘭0.5g，溶于100mL磷酸緩沖液中，溶解后濾紙過(guò)濾，室溫保存。
5、0.1%結(jié)晶紫的配制
稱0.1結(jié)晶紫，溶于0.1N的100mL檸檬酸溶液中，(即2.1g檸檬酸加水100mL)， 置37℃溶解24小時(shí)，分裝備用。
三、培養(yǎng)基
維持體外培養(yǎng)細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的液相基質(zhì)，稱細(xì)胞培養(yǎng)基或簡(jiǎn)稱培養(yǎng)液。理想的培養(yǎng)液必須具備以下條件：
(1)保持正常細(xì)胞滲透壓及pH緩沖系統(tǒng)。
(2)必須供給細(xì)胞基本營(yíng)養(yǎng)物，包括細(xì)胞合成代謝、能量代謝及微量元素等。
(3)培養(yǎng)液中沒(méi)有毒物或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。
(4)各種基本成分的量合適，互相之間具有平衡關(guān)系，能精確定量調(diào)整。
(5)容易制成成品，生產(chǎn)簡(jiǎn)單，最好能高壓滅菌。
培養(yǎng)基的種類較多，作用略有差別。凡是能供細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基稱為生長(zhǎng)液。若細(xì)胞生長(zhǎng)快，在生長(zhǎng)液中維持時(shí)間不長(zhǎng)，可從瓶壁脫落下來(lái)，或者由于生長(zhǎng)密度過(guò)大，使顯微鏡觀察困難。為避免此現(xiàn)象的出現(xiàn)，常在細(xì)胞成片后改換成維持液，這種維持液可使細(xì)胞在數(shù)周內(nèi)處于良好的狀態(tài)，特性不變，可隨時(shí)供應(yīng)。此種維持液為無(wú)血清或低血清(2%)培養(yǎng)液。如199培養(yǎng)液不加血清就是良好的維持培養(yǎng)基。有時(shí)此種培養(yǎng)基中加入明膠或脫脂乳。還有一種由Smith設(shè)計(jì)的、含有超濾的肝消化物作為維持培養(yǎng)基。
(一)天然培養(yǎng)基(natural medium)
天然培養(yǎng)基主要是取自動(dòng)物體液或從動(dòng)物組織分離提取的物質(zhì)，如血清、雞血漿、雞胚浸出液等。其營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)細(xì)胞有效。最初的體外細(xì)胞培養(yǎng)大多用這種培養(yǎng)基。但由于成分復(fù)雜，個(gè)體差異大，來(lái)源有限，又很難標(biāo)準(zhǔn)化，所以實(shí)際工作中，往往是天然培養(yǎng)基結(jié)合在人工培養(yǎng)基中使用。如血清和水解乳蛋白是使用非常廣泛的天然培養(yǎng)基，市場(chǎng)有現(xiàn)成產(chǎn)品出售，不需自制，可省去許多麻煩。
1、血清
血清是全血凝固后分離上清液而得的制品，其除了含有供給細(xì)胞生長(zhǎng)所不可缺少的營(yíng)養(yǎng)成分外，還使細(xì)胞合成DNA，提供細(xì)胞增殖所必須的生長(zhǎng)因子。血清的主要成分為蛋白質(zhì)、多肽、激素、氨基酸、葡萄糖、銅酸等。
細(xì)胞培養(yǎng)最常用的是牛血清，除了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較其他血清高，還有以下優(yōu)點(diǎn)：
（1）它的胎盤(pán)能阻止母體的免疫球蛋白進(jìn)入胎牛而沒(méi)有抗體等的抑制效應(yīng)物質(zhì)。
（2）較易獲得。牛血清共分三類：
①小牛血清(calf serum)，取年齡在6個(gè)月，體重達(dá)226kg的小牛放血致死而得。
②新生小牛血清(new born calf serum),出生5天內(nèi)的小牛放血后得。
③胎牛血清(fetal borvine serum)，以無(wú)菌手術(shù)剖腹后取胎(210～300天胎齡)，穿刺心臟采血制得。
一般市售血清均為混合血清，有成分互補(bǔ)的優(yōu)點(diǎn)，更適宜于細(xì)胞生長(zhǎng)。
購(gòu)置的血清應(yīng)做熱滅活處理。將小牛血清置于56℃水浴中滅活30分鐘，以破壞補(bǔ)體及一些污染微生物(如病毒、支原體等)，放置4℃冰箱中，無(wú)菌試驗(yàn)陰性。未滅活的血清不穩(wěn)定，應(yīng)保存于-20℃冰箱中。
血清雖對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)極為重要，但其成分復(fù)雜，作用機(jī)制尚未完全了解，加上供血?jiǎng)游锏膫€(gè)體差異，其中有些成分對(duì)分析細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)不利，有的甚至對(duì)細(xì)胞有害。所以在生長(zhǎng)液中血清使用濃度為10%～20%，維持液為2%～3%，有時(shí)根據(jù)培養(yǎng)目的，甚至需要用無(wú)血清培養(yǎng)基。
2、水解乳蛋白(hydrolytic albumin)
水解乳蛋白也是一種常用的天然培養(yǎng)基。它是乳蛋白經(jīng)蛋白酶和肽酶混合物水解而得的制品，為一種均勻淡黃色或灰黃色粉末，有潮解性，故常密封保存在陰涼干燥處。其水溶液呈弱酸性，不溶于醇或醚。常用濃度為0.2%～5%，用平衡鹽溶液配制。0.4%濃度的水解乳蛋白經(jīng)分解后幾乎與人血漿中氨基酸成分相當(dāng)。在此培養(yǎng)基中再加入血清，可培養(yǎng)很多種細(xì)胞。市售產(chǎn)品每批都有差別，應(yīng)先預(yù)試。
0.5%水解乳蛋白的配制：稱取0.5g水解乳蛋白粉末，用少許滅菌的Hanks液調(diào)成糊狀，再補(bǔ)充Hanks液至100mL，待充分溶解(室溫置1~2h)后，粗濾分裝，以115℃20分鐘高壓蒸汽滅菌，無(wú)菌試驗(yàn)陰性，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>
3、酵母浸出液
該液在無(wú)血清蛋白存在時(shí)可促使細(xì)胞增殖。酵母浸出物中有幾種結(jié)合蛋白的物質(zhì)對(duì)增加細(xì)胞的生長(zhǎng)率特別有利。它還含有豐富的維生素，故天然培養(yǎng)基中也常加有酵母浸出物成分，常用濃度為0.1%。
4、雞胚浸出液
雞胚浸出液含有生長(zhǎng)因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，可刺激細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，幾乎各種組織細(xì)胞培養(yǎng)物都可使用。常用濃度不能超過(guò)30%。近幾年，由于培養(yǎng)基的廣泛使用，雞胚浸出液的使用已大為減少。
雞胚浸出液的制備：取孵育10～20天的雞胚，用洗液洗三次后剪碎或攪拌后加入Hanks液并攪均勻，注意氣囊、膜囊和尿囊膜必須剝離去除。置室溫或在37℃下孵育30分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間，并采取凍融方法以助析出浸出液。2000r/min離心沉淀20分鐘，取出上清，作無(wú)菌試驗(yàn)陰性，加雙抗；分裝后低溫保存，也可采用過(guò)濾法除菌。
5、雞血漿
雞血漿含有纖維蛋白原和其他一些營(yíng)養(yǎng)成分，是使用最早的天然培養(yǎng)基。缺點(diǎn)是易于液化，故很少單獨(dú)使用。
雞血漿制備：在無(wú)菌條件下配制0.2%生理鹽水肝素液，115℃20分鐘高壓滅菌或過(guò)濾除菌，分裝入小瓶。取消毒過(guò)的干燥注射器先吸少許肝素，濕潤(rùn)針管內(nèi)壁，選擇年幼的雞，從翼靜脈采血。3000 r/min 離心10分鐘,分裝入小瓶,于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>
6、胰酶消化牛心肌浸液
該浸液主要用作支原體檢查。制備方法如下：
（1）新鮮牛心用蒸餾水洗兩次，切開(kāi)除去內(nèi)膜、脂肪及結(jié)締組織等，用絞肉機(jī)將心肌絞碎，稱取250g加雙蒸水900mL，加NaCl 5g，放入三角燒瓶?jī)?nèi)。
（2）56℃水溶加溫10～20分鐘，再加入胰酶2.5g，待胰酶全部溶解后用NaoH調(diào)節(jié)pH至8.0，以增強(qiáng)消化能力，于56℃消化2小時(shí)，并不斷攪拌，保持pH8.0左右。
（3）將心肌消化懸液用HCl調(diào)至pH6.0左右，煮沸5-10分鐘，再用四層紗布濾去肉渣，略加壓力將肉汁擠出，將浸出液加雙蒸水至1000mL。
（4）加酵母浸膏1g攪拌之，調(diào)pH至8.0再煮5分鐘，四層紗布（中間墊一層脫脂棉）過(guò)濾，再用cp濾紙過(guò)濾，pH保持在8.0，即成牛的心肌浸液，115℃15分鐘高壓滅菌，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/span>
(二)人工合成培養(yǎng)基
天然培養(yǎng)基的來(lái)源是有限的，要進(jìn)行大量體外細(xì)胞培養(yǎng)，需要選用人工合成的各種化學(xué)物質(zhì)配制而成的、又利于細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。1950年，Morgan提出了包括69種成分的199配方，開(kāi)始了人工合成培養(yǎng)基的歷史，它是在平衡鹽溶液中加入標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而構(gòu)成的培養(yǎng)基。隨著生物化學(xué)的飛躍發(fā)展，人們不斷應(yīng)用生化提純或人工合成的各種化學(xué)物質(zhì)設(shè)計(jì)出許多種合成培養(yǎng)基的配方，企圖找到最有利于組織細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液，如199，Eagle 、RPMI1640、HAMF12、NCT109等。
1、人工合成培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)
人工合成培養(yǎng)基具有以下優(yōu)點(diǎn)：
（1）人工培養(yǎng)基是用已知成分配制，培養(yǎng)條件一致。
（2）它可以精密地測(cè)定培養(yǎng)的細(xì)胞與培養(yǎng)液內(nèi)物質(zhì)變化的情況，用生化定量的方法可以分析各種組織以及各種實(shí)驗(yàn)條件下不同組織細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝，這也可提供和篩選更加有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的更趨簡(jiǎn)化的培養(yǎng)基。
（3）用人工培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞比較透明清楚，胞漿內(nèi)的顆粒很少，換液時(shí)間可適當(dāng)延長(zhǎng)，從而節(jié)省人力、物力。
（4）人工合成培養(yǎng)基克服了天然培養(yǎng)基中可能潛在病毒污染的缺點(diǎn)，有利于培養(yǎng)和研究病毒。
（5）培養(yǎng)基成分便于儲(chǔ)存和大量配制，便于細(xì)胞大量生產(chǎn)。
2、人工合成培養(yǎng)基的成分
人工合成培養(yǎng)基的主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú)機(jī)離子及其他一些輔助物質(zhì)。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要作用見(jiàn)前一章。
隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，人工合成培養(yǎng)基不僅品種增加，配方相對(duì)固定，并形成配制好的干粉型商品，而且培養(yǎng)基成分趨于簡(jiǎn)單化。現(xiàn)今市售的Eagle、RPMI1640和DMEM等培養(yǎng)液比以前已有了較大改進(jìn)，增減了一些成分，以滿足細(xì)胞培養(yǎng)中新技術(shù)的需要。如雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM培養(yǎng)基，使用時(shí)需補(bǔ)加丙酮酸鈉和2-硫基乙醇（2-mercaptoethanol,2-Me），以促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和DNA合成，增加細(xì)胞轉(zhuǎn)化。2-Me常配制成0.1mol/L的貯存液，用時(shí)每升培養(yǎng)液加0.5mL。PHA有市售的商品。
3、幾種常用人工合成培養(yǎng)基的配制
(1)RPMI1640培養(yǎng)液 稱10.4g粉末(市售進(jìn)口產(chǎn)品一般為一包)，溶于1000mL三蒸水中，待溶解后通入CO2約5分鐘，至液體呈檸檬色后加入0.3g/L谷氨酰胺，或先用1 N HCl調(diào)至pH6.8以下，后用1 N NaOH調(diào)至pH7.2～pH7.4；用無(wú)菌玻璃濾器或金屬濾器0.22μm或0.3μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，按所需量分裝,置低溫保存。
(2)Eagle基礎(chǔ)培養(yǎng)基 稱9.4g粉末(一小包)加入1000mL三蒸水中，待完全溶解后采用121℃高壓蒸氣滅菌15分鐘，臨用前按比例加入谷氨酰胺，并用10%NaHCO312.5mL～22mL(或通入CO2)，調(diào)pH7.２～pH7.4，過(guò)濾除菌，低溫保存。
(3)生長(zhǎng)培養(yǎng)液 根據(jù)各種細(xì)胞培養(yǎng)的需要，在配制人工合成培養(yǎng)基時(shí)，尚需加入一定量的天然合成培養(yǎng)液，構(gòu)成最適合細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)液，加入適量血清的生長(zhǎng)液就是其中的一種。這種培養(yǎng)液主要為細(xì)胞生長(zhǎng)增殖之用，所含血清比例較大。一般配法：基本培養(yǎng)基80%～90%，小牛血清10%～20%，并加雙抗生素(青霉素100U/mL，鏈霉素100μg/ml)，上述比例如有特定需要，可根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)要求進(jìn)行增減。
(4)維持液 這也是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上配制的細(xì)胞培養(yǎng)用液，主要作用是維持細(xì)胞緩慢生長(zhǎng)而不死。一般血清含量較少，通常基本培養(yǎng)基為97%～98%，小牛血清3%～2%。
(5)無(wú)血清培養(yǎng)基 因血清所含成分復(fù)雜，同時(shí)也含有一些不可控因素，細(xì)胞毒性物質(zhì)和抑制物，不僅影響細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞某些功能的表達(dá)，有的還會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生去分化作用，影響一些基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究的結(jié)果。因此，一些技術(shù)要求和研究目的較高的細(xì)胞培養(yǎng)，如細(xì)胞生長(zhǎng)因子研究和制備、單克隆抗體制備、細(xì)胞分泌產(chǎn)物的研究和制備等，都須用無(wú)血清培養(yǎng)基，以減少或去除異種蛋白及干擾因素。不僅對(duì)產(chǎn)品純化提取有益，而且可避免異種血清所引起的過(guò)敏反應(yīng)。
無(wú)血清培養(yǎng)基主要有基礎(chǔ)培養(yǎng)基和輔加成分組成，基礎(chǔ)培養(yǎng)基一般用人工合成培養(yǎng)基，最常用的是HamF12和DMEM培養(yǎng)基1:1混合。然后補(bǔ)加15mmol/L Hepes1.2g/mL，NaHCO3作為基礎(chǔ)溶液。輔加成分有：
①促貼壁附著成分，如 纖維粘連蛋白，層粘連蛋白膠原等。
②促生長(zhǎng)增殖成分，如 一些生長(zhǎng)因子和激素。
③蛋白酶抑制物，如 大豆胰蛋白酶抑制劑（Soybean trypsin inhibitor）。
這些輔加成分根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)條件和實(shí)驗(yàn)要求添加。一般先配好儲(chǔ)存液，過(guò)濾除菌，低溫保存，要避免反復(fù)凍融。使用濃度和使用方法各不相同。如纖維粘連蛋白的配制濃度為25mg～50mg/L，用時(shí)先涂在培養(yǎng)瓶皿支持物上；層粘連蛋白1mg～5mg/L，可直接加在培養(yǎng)液中。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子配制濃度2mg/L，使用濃度5μg /L，可直接加入培養(yǎng)液中；大豆胰蛋白酶抑制劑，使用濃度為0.1%～0.5%，通常配制在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中。
