一、四唑鹽(MTT)比色法

檢測(cè)細(xì)胞存活和生長(zhǎng)的方法除前面所介紹的方法外，還可用四唑鹽比色試驗(yàn)(MTT)。由于這種方法與細(xì)胞計(jì)數(shù)法、軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)和³H-TdR摻入試驗(yàn)有良好的相關(guān)性，且靈敏度高、重復(fù)性好、無(wú)放射性污染等，所以常用于細(xì)胞活力的檢測(cè)。此法的主要原理是：活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)，以在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。此法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測(cè)、抗腫瘤藥物的篩選、細(xì)胞毒性試驗(yàn)和腫瘤放射敏感性的測(cè)定等。

基本步驟：

（1）用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞使其成為單細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液配成1×10⁹細(xì)胞/L的單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL。

(2)將培養(yǎng)板置CO₂孵箱中，在37℃ 5% CO₂條件下，培養(yǎng)3～5天(根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?/span>)。

(3)培養(yǎng)3～5天后，每孔加入MTT溶液(將MTT按5mg/mL溶于0.01mol/L，pH7.2的PBS中，輕輕吹打至全部溶解，過(guò)濾除菌，4℃避光保存，保存時(shí)間一般不超過(guò)兩周)10μL，繼續(xù)置培養(yǎng)箱孵育3～6小時(shí)，終止培養(yǎng)，加10%SDS-HCl 100μL/孔37°C數(shù)小時(shí)，將細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周?chē)?/span>MTT一甲月贊  顆粒充分溶解。

（4）用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光吸收值(OD)，選波長(zhǎng)490nm。以時(shí)間為橫軸，光吸收值為縱軸繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

用此法測(cè)細(xì)胞活力，為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，最好在試驗(yàn)前測(cè)定每種細(xì)胞的貼壁率、倍增時(shí)間以及不同接種細(xì)胞數(shù)條件下的生長(zhǎng)曲線，再確定每孔細(xì)胞接種數(shù)和培養(yǎng)時(shí)間，以保證培養(yǎng)終止時(shí)不至過(guò)滿(mǎn)。另外，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)設(shè)空白對(duì)照，比色時(shí)，以空白孔調(diào)零。

二、細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測(cè)定法(考馬斯亮藍(lán)測(cè)定法)

此法基本原理是：考馬斯亮藍(lán)在酸性溶液與蛋白質(zhì)結(jié)合，在595nm波長(zhǎng)處呈最大吸收，其光吸收值與蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)。此法主要用于測(cè)定酶、受體及細(xì)胞外代謝產(chǎn)物特異性活性的度量單位。

基本步驟：

（1）用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成懸液，用10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1×10⁴細(xì)胞/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1mL，置37℃ 5%CO₂條件下培養(yǎng)一定時(shí)間。

（2）用胰蛋白酶消化分散，培養(yǎng)板的細(xì)胞懸浮在PBS中，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，取10⁶細(xì)胞以1000r/min離心5分鐘，棄上清液，加0.5ml 0.1%SDS或0.3mol/L NaOH，置100℃煮3分鐘，使細(xì)胞裂解。

（3）取0.1mL考馬斯亮藍(lán)染液與100μL上述細(xì)胞裂解液混勻，放置10分鐘。

（4）用可見(jiàn)光分光光度計(jì)在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定溶液的光吸收值。以溶劑為空白對(duì)照，以已知量的牛血清蛋白蛋白（BSA1～50μg）為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算樣品中蛋白質(zhì)含量。

三、細(xì)胞蛋白質(zhì)合成的³H-亮氨酸摻入試驗(yàn)

此法的基本原理是，細(xì)胞在合成蛋白質(zhì)時(shí)需攝取外源性氨基酸，用同位素標(biāo)記氨基酸如³H-亮氨酸可以摻入細(xì)胞蛋白質(zhì)合成代謝中，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可了解細(xì)胞蛋白質(zhì)合成代謝狀況。

基本步驟：

（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化，懸浮于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞密度至10⁷～10⁹/L，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1mL。

（2）將培養(yǎng)板置37℃ 5% CO₂孵箱中培養(yǎng)至細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，每孔加100μL預(yù)溫37℃的³H-亮氨酸(終濃度為1.85×10⁸Bq/mL)。

（3）繼續(xù)培養(yǎng)4～24小時(shí)(根據(jù)預(yù)先摸索的摻入時(shí)間定)。

（4）終止培養(yǎng)，取出培養(yǎng)板，小心吸出培養(yǎng)上清液，用預(yù)冷的PBS小心洗滌，晾干。如果細(xì)胞松散，可先用甲醇固定10分鐘。

（5）把培養(yǎng)板放在冰蓋上，每孔加1mL 10%三氯醋酸(TCA)，在4℃放置10分鐘，吸取上清液。

（6）用甲醇洗滌、晾干。

（7）每孔加0.5mL 10.3mol/L NaOH，1% SDS,室溫下放置30分鐘。

（8）混勻、移入閃爍瓶中，加5mL閃爍液，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分脈沖數(shù)(cpm)，以cpm/10⁶細(xì)胞或cpm/mg蛋白表示。

對(duì)懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞則采用離心法處理。

四、細(xì)胞DNA合成測(cè)定

(一)³H-TdR摻入法

此法的基本原理是：胸腺嘧啶核苷(TdR)是DNA特有的堿基，也是DNA合成的必需物質(zhì)，。用同位素³H標(biāo)記TdR即³H-TdR作為DNA合成的前體能摻入DAN合成代謝過(guò)程，通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，可以反映細(xì)胞DAN的代謝及細(xì)胞增殖情況。

基本步驟：

（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制成3×10⁸細(xì)胞/L的細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL。

（2）將培養(yǎng)板放入37℃ 5%CO₂孵箱中培養(yǎng)24小時(shí)左右。

（3）在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，每孔加入100μL ³H-TdR(用HBSS配制3.7×10⁸Bq/mL濃度，過(guò)濾除菌)，使終濃度為3.7×10⁷Bq/mL。

（4）繼續(xù)培養(yǎng)1～24小時(shí)(根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求確定)。

（5）終止培養(yǎng)，小心吸棄培養(yǎng)上清液，用HBSS漂洗單層細(xì)胞2次，然后加2mL預(yù)冷的10%TCA(三氯醋酸)，放置10分鐘。如果細(xì)胞松散，應(yīng)先用甲醇固定10分鐘。再用10%TCA重復(fù)洗2次，每次5分鐘。

（6）每孔加0.5mL 0.3mol/L NaOH,在60℃處理30分鐘，然后使之冷至室溫。

（7）收集上述裂解液，移入閃爍瓶中，加5mL閃爍液，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)(cpm),結(jié)果以cpm/10⁶細(xì)胞表示。

(二)流式細(xì)胞儀測(cè)定DNA合成

用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞增殖同期和DNA合成是90年代發(fā)展起來(lái)的新手段，不僅快速、準(zhǔn)確、效果好，而且消除同位素標(biāo)記的許多繁瑣方法和放射性污染。

基本檢測(cè)程序：

（1）取80%至接近匯合的細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度1×10⁹細(xì)胞/L，注意不能留有細(xì)胞碎片。

（2）進(jìn)行流式儀檢測(cè)。除檢測(cè)細(xì)胞周期時(shí)相變化和反應(yīng)DNA合成情況外，還可了解染色體倍性；結(jié)合熒光免疫法，還可對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行分析等。