金黃色葡萄球菌基因敲除服務簡介

我們的金黃色葡萄球菌基因敲除載體系統是基于pKOR1載體而構建的，它是一個可以在革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌中都可以啟動質粒復制的載體，同時也是金黃色葡萄球菌同源重組載體溫度敏感型自殺質粒。repF復制子pLE194Ts是溫度敏感性復制子，在30℃以下可以復制，在42℃以上溫度無法復制，所以通過溫度篩選的方法獲得基因缺失株；另外該復制子中還包含一段金黃色葡萄球菌重組酶基因，該基因有利有同源交換的進行。

 

優勢

1. 溫度敏感型自殺質粒pKOR1可做到無痕敲除。

2. 可提供修飾外源質粒的金黃色葡萄球菌：金黃色葡萄球菌RN4220是從NCTC8325的突變體中篩選得到的突變株，可以相對較高效地轉化大腸桿菌來源的DNA質粒。  

3. 豐富的金黃色葡萄球菌基因敲除經驗：可根據客戶需求選擇合適的載體，為客戶進行敲除條件的摸索及優化。

4. 一站式服務：引物設計及優化、基因敲除質粒構建，敲除菌株篩選及后續處理、數據及報告整理。  

實驗方案

實驗菌株：

金黃色葡萄球菌M28A：

敲除株，BHI培養基培養，經藥物敏感性預實驗結果，選用紅霉素抗性基因來敲除目的基因。

金黃色葡萄球菌RN4220：

ccdB Survival DB3.1：感受態。

實驗質粒：

pKOR1：

金黃色葡萄球菌同源重組載體溫度敏感型自殺質粒。

pMG36e：

擴增紅霉素抗性基因。

實驗準備：

提取M28A基因組、pKOR1和pMG36e質粒，備用。

實驗方案/步驟：

一、構建pKOR1敲除載體

1、擴增terL基因的5’和3’側翼序列及紅霉素抗性基因

50 µL反應體系：

反應程序： 

1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收產物，測定產物濃度，備用。

2、融合PCR擴增TerL的5’-erm-TerL的3’片段

50 µL反應體系：

反應程序：

1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收產物，測定產物濃度，備用。

3、PCR擴增構建載體的敲除盒片段

50 µL反應體系：

反應程序：

1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收產物，測定產物濃度，備用。

4、酶切質粒

將載體進行雙酶切（KpnI、SacI），體系如下：

輕輕混勻后瞬時離心，37℃保溫 60min；回收產物測定濃度。

5、連接

碧云天同源重組試劑盒載體構建

上述反應體系置于50℃孵育15min。

6、熱激轉化ccdB Survival DB3.1

（1）吸取100μL感受態細胞液至小離心管中，加入質粒DNA。(DNA不超過10μL, 小于50ng) 輕旋混合，置于冰上30min；

（2）42°C循環水浴，靜止放置90s；

（3）快速轉移到冰浴，冷卻2~5min；

（4）每管加800µL LB培養基, 短暫回溫后，置于37°C, 180rpm搖床培育45min；

（5）吸取適量轉化后感受態細胞, 涂板于含有300µg/mL氨芐抗性的LB瓊脂平板上；

（6）將平板置于37°C恒溫暗培養箱中, 先正面培養30min, 隨后倒置培養。(隔夜，15h左右可見菌落)。

（7）挑取若干菌落于2mL含300µg/mL氨芐抗性的LB肉湯中培養，菌液進行PCR鑒定。

7、PCR鑒定與測序驗證

20 µL反應體系：

反應程序：

1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性菌落送測序驗證。測序結果與模板序列一致，則敲除載體構建成功，進行下一階段實驗。

二、電轉化RN4220修飾敲除載體

1、提取DB3.1中的敲除質粒；

2、制備RN4220感受態：

①　挑取單菌落于B2肉湯中在37℃過夜培養；

②　以1/25的比例轉接到新鮮的25 mL B2肉湯中(300 mL培養瓶)，37℃振蕩培養至對數生長期；

③　離心收集菌體；

④　等體積的去離子水洗滌3次；

⑤　用1/5和1/10體積的10%甘油洗滌2次；

⑥　1/10體積的10%甘油中孵育15min；

⑦　離心后，800 µL的10%甘油重懸；

⑧　分裝70µL/份，-80℃冰箱中保存待用。

所有洗滌液和孵育條件均為20°C，所有離心均為800rpm、10 min。

3、在參數為25 μF，2.5 kV，200 ?的電轉條件下，將0.5 μg敲除質粒電轉入RN4220感受態；

4、含25μg/mL氯霉素的BHIA篩選。

三、敲除載體電轉化M28A和初篩敲除株

1、提取RN4220中的敲除質粒；

2、制備M28A感受態，方法同上；

3、在參數為25 μF，2.5 kV，200 ?的電轉條件下，將敲除質粒電轉入M28A感受態細菌中，并涂板于氯霉素抗性的BHI平板上；

4、挑取平板上長出的單菌落過夜培養后1:100接種于5 mL不含抗生素的BHI培養基中；

5、42 ℃振蕩培養24 h后，再將培養產物1:100接種于5 mL不含抗生素的BHI培養基中，25 ℃振蕩培養24 h；

6、重復上述步驟2次后將培養產物三線法劃線于不含抗生素的BHI平板，置37 ℃恒溫培養箱培養24 h；

7、挑取單菌落分別接種至含50μg/mL紅霉素的BHI平板和含25μg/mL氯霉素的BHI平板，置37℃恒溫培養箱培養24 h；

8、其中在紅霉素平板上生長，而在氯霉素平板上不生長的菌落為初篩重組成功的terL基因敲除株。

四、敲除株的鑒定

分別以初篩重組成功的terL基因敲除株染色體基因組DNA和M28A染色體基因組DNA為模板進行多重PCR鑒定。

所用引物如下表：

若初篩敲除株的鑒定結果：①為陰性，②、③、④為陽性，則證明敲除成功。