中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CTLA4 Ig-24)介紹：CHO 細(xì)胞以人CTLA-4 基因細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列和人IgCgamma1 的絞鏈區(qū)，CH2 和CH#區(qū)序列的融合結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染，構(gòu)建了這株細(xì)胞。它們表達(dá)融合蛋白(CTLA4Ig)。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CTLA4 Ig-24)特性：

1） 來(lái)源：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢

2） 形態(tài)：可貼壁生長(zhǎng)（上皮細(xì)胞樣），也可懸浮生長(zhǎng)（圓球形）

3） 含量：>1x106 個(gè)/mL

4） 污染：支原體、細(xì)菌、酵母和真菌檢測(cè)為陰性

5） 規(guī)格：T25 瓶或者1mL 凍存管包裝

運(yùn)輸和保存：使用含有優(yōu)質(zhì)胎牛血清的2ml 凍存管發(fā)送存活細(xì)胞。收到細(xì)胞后，可在1000RPM，常溫條件下，離心5min 后，于潔凈操作臺(tái)棄去上清，加入推薦使用的培養(yǎng)基后轉(zhuǎn)移至10cm 培養(yǎng)皿或者T25 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，傳代達(dá)到細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，再進(jìn)行凍存。具體操作見(jiàn)細(xì)胞培養(yǎng)步驟。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CTLA4 Ig-24)用途：僅供科研使用。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CTLA4 Ig-24)培養(yǎng)步驟：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

培養(yǎng)條件：貼壁生長(zhǎng)時(shí)，選擇DMEM-H 培養(yǎng)基(DMEM-H:GIBCO,貨號(hào)12800017, 添加NaHCO3 1.5g/L, 添加0.2 mM 脯氨酸,0.001 mM 氨甲蝶呤)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

[MTX 是基因DHFR 產(chǎn)物的抑制物。當(dāng)培養(yǎng)基中存在MTX 時(shí)，MTX 可滲入細(xì)胞內(nèi)與DHFR 蛋白結(jié)合，使核苷酸的合成受阻。但是DHFR 基因連同其附近幾千KB的DNA 還會(huì)擴(kuò)增以滿足核苷酸合成的需要。理論上MTX 濃度越大，DHFR 基因擴(kuò)增越多，與DHFR 基因連鎖的目的蛋白基因也表達(dá)得越多]

懸浮培養(yǎng)時(shí)，請(qǐng)使用懸浮生長(zhǎng)專用培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為：EX-CELL CD-CHO CHOSerum-free Medium,Chemically Defined(Sigma-Aldrich,貨號(hào)：24361C)添加物：L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich,貨號(hào)：G8540-25G）Anti-Clumping Agent(Gibco，貨號(hào)：01-0057AE)

備注：CD-CHO CHO Serum-free Medium 請(qǐng)按照培養(yǎng)基配制說(shuō)明書配制，L-谷氨酰胺配制濃度為200mM，工作濃度為8mM（即稀釋25 倍，如500ml CHO Serum-freeMedium 中添加20ml 200mM L-谷氨酰胺，抗結(jié)團(tuán)劑使用為1%，即500ml CHOSerum-free Medium 中添加5ml 抗結(jié)團(tuán)劑）

1）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37 攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

2）凍存液：90%完全培養(yǎng)基（貼壁生長(zhǎng)凍存時(shí)）或90%懸浮培養(yǎng)基（懸浮生長(zhǎng)時(shí)），10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1） 復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL 培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)?span lang="EN-US">細(xì)胞懸液加入10cm 皿中，加入約8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞1-2 次。

2. 加2ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3. 按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按1：2 到1：5 的比例分到新的含8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM 條件下離心4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2 到1：5 的比例分到新的含8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2 到1：3 的比例分到新的含8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml 含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO 后進(jìn)行凍存。懸浮細(xì)胞凍存時(shí)，應(yīng)將細(xì)胞收集，1000RPM 條件下離心4 分鐘，少量保存上清液（防止細(xì)胞吸走），加入部分新鮮培養(yǎng)基，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO 后進(jìn)行凍存。

注意事項(xiàng)：

1. 收到細(xì)胞后，若發(fā)現(xiàn)干冰已揮發(fā)干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細(xì)胞有污染，請(qǐng)立即與我們聯(lián)系。

2. 所有動(dòng)物細(xì)胞均視為有潛在的生物危害性，必須在二級(jí)生物安全臺(tái)內(nèi)操作，并請(qǐng)注意防護(hù)，所有廢液及接觸過(guò)此細(xì)胞的器皿需要滅菌后方能丟棄。